Laboratorio de Fotoquímica y Fotobiología Molecular

Directores

  • Dr. Franco M. Cabrerizo Investigador Independiente CONICET - Profesor Asociado UNSAM

 

  • Dra. M. Paula Denofrio Investigador Adjunto CONICET Profesor Adjunto UNSAM

 

 

Miembros actuales:

Dra. M. Micaela Gonzalez (Investigadora Asistente-CONICET, Prof. Adjunto-UNSAM)
Dra. M. Lis Alomar (Investigadora Asistente-CONICET)
Lic. Gabriel Yañuk (Becario Doctoral CONICET)
Lic. Ivan Maisuls (Becario Doctoral CONICET)
Ing. Fernando Villarruel (Becario Doctoral ANPCyT)
Sr. Carlos G. Alberici (Técnico Asociado-CPA CONICET)

 

Ex-Integrantes:

Dra. Karina Levy (Becaria Postdoctoral CONICET; 2013-2015 Investigadora Asistente-CONICET; 2015-2016)
Dra. Mariana Vignoni (Postdoctorado; 2012-2013)
Dr. Fabricio Ragone (Becario Postdoctoral CONICET)
Dr. Federico A. O. Rasse-Suriani (Becario Doctoral CONICET; 2011-2016)
Matías Alés-Gandolfo (Tesina de grado; 2011)
Ing. Fernando Villarruel (Tesina de grado, 2016)
Ing. Francisco Simon (Tesina de grado, 2016)

Lic. Mariangeles Carra (Becario Doctoral CONICET)

 

  • Líneas de Investigación

Estudio de las propiedades fotoquímicas y fotofísicas, en medio acuoso, de alcaloides pertenecientes a la familia de las β-carbolinas (βCs).

1) Estudio de las propiedades fotoquímicas y fotofísicas, en medio acuoso, de alcaloides pertenecientes a la familia de las β-carbolinas

Las β-carbolinas (βCs) son un grupo de compuestos heterocíclicos nitrogenados derivados del norharmano (Esquema 1). Estos alcaloides forman parte de los componentes normales de una gran variedad de biosistemas (animales, plantas, insectos, etc.) y, consecuentemente, forman parte de alimentos, bebidas, etc. In vivo se forman mediante la condensación de Pictet-Spengler a partir del aminoácido triptófano y un aldehído. En mamíferos estos compuestos forman parte constitutiva de órganos, tejidos y fluidos corporales (ojos, piel, plasma, orina, etc.). Experimentos realizados con lactantes demostraron que una fracción de las tetrahidro-βCs halladas en orina es sintetizada posiblemente por bacterias del intestino de los infantes. En humanos, bajo ciertas condiciones, como por ejemplo el consumo de alcohol y tabaco, los niveles plasmáticos basales de harmano y norharmano (~ 0,1 nmol/l) aumentan considerablemente (~ 1 nmol/l). Este aumento de la concentración plasmática de estos alcaloides sería consecuencia de la inhalación del humo de tabaco, más que de un aumento en la formación endógena de esta βC.

Se ha sugerido que las βCs tienen un rol muy activo en un gran número de procesos biológicos normales, como así también en el origen de diferentes patologías tales como el Parkinson, cáncer, y en otras inducidas por la radiación. Por ejemplo, bajo irradiación UVA norharmano y harmano son capaces de generar daño en los cromosomas de las células eucariotas, y también son capaces de inactivar distintas bacterias y virus. Por otra parte, se ha propuesto que el principal rol biológico de las βCs presentes en las plantas estaría relacionado con los mecanismos de defensa (principalmente por acción fototóxica) contra insectos y otros agentes invasores. Sin embargo, hasta el momento aún existen controversias acerca de cuál es el principal rol fitológico y fisiológico de estos alcaloides, como así también los mecanismos de acción de dichos procesos.

Figura 1. Estructura química de las βCs más representativas. En solución acuosa, βCs presentan un equilibrio ácido-base con un valore de pKa ~ 7. El átomo de nitrógeno del anillo indólico presenta un valore de pKa cercano a 12. X puede ser: -Cl, -Br, -NO2; R1 y R2 = -H o -CH3 y R3 = -H o -OCH3

- Fotofísica de β-carbolinas (βCs) en solución acuosa bajo condiciones de excitación mono- y bi-fotónica.

Los estudios se enfocan, principalmente, en la caracterización de las propiedades fotofísicas y espectroscópicas de βCs, en solución acuosa, bajo régimen de excitación monofotónica y su dependencia con el pH y la concentración de oxígeno disuelto en el medio. Típicamente, se determinan parámetros tales como rendimientos cuánticos de fluorescencia y fosforescencia (a temperatura ambiente y a 77 K), rendimientos cuánticos de producción de Especies Reactivas de Oxígeno (EROs) (oxígeno singlete, etc.), rendimientos cuánticos de formación de estados tripletes, tiempos de vida de fluorescencia y fosforescencia, etc.

Por otra parte, se realizan estudios bajo condiciones de excitación bifotónica (figura 2). Estos estudios se llevan adelante en colaboración con el Dr. Ogilby (Dinamarca). Brevemente, se denomina absorción bifotónica (TPA, del inglés Two-Photon Absorption) al proceso en el cual ocurre la absorción simultánea en tiempo (10-15–10-16 s) y espacio de 2 fotones de menor energía que, consecuentemente, son capaces de excitar a una molécula, generalmente desde S0 a estados electrónicos de mayor energía (Sn). En particular, se construyen espectros de absorción bifotónica (TPA), se calculan los valores N NH+ R7 R1 R9 N N R7 R1 R9 OHH+ forma protonada forma neutra X6 X8 X6 X8 de cross section (δ) y se evalúa la capacidad de producción 1O2. Brevemente, los principales resultados obtenidos por el grupo se pueden resumir en: (i) las βCs pueden presentar valores de δ no despreciables en una región del espectro desplazada significativamente hacia el rojo, comparado con el proceso de absorción monofotónica. La magnitud de δ depende tanto del pH de la solución, como así también del sustituyente en el anillo de βC. (ii) Las βCs son capaces de producir 1O2 bajo excitación bifotónica. (iii) Se evaluó, además, el efecto del solvente en relación al TPA. Se llevaron a cabo determinaciones sobre derivados clorados de βC en H2 O, D2O y acetonitrilo. Estos resultados son de gran relevancia porque muestran la presencia de efecto del solvente en el cambio de simetría molecular, como consecuencia de pequeñas interacciones (i.e., puente de hidrógeno).

El conocimiento y la caracterización de los estados excitados permiten comprender y evaluar el rol de estos alcaloides en los diferentes procesos foto-dependientes en los que participarían. Por su parte, los estudios bajo condiciones de excitación bifotónica tienen gran relevancia y presentan numerosas ramificaciones, por ejemplo, en estudios bajo condiciones intracelulares donde se desea excitar selectivamente a una βC presente en un sistema biológico determinado, excluyendo la excitación de otros cromóforos endógenos. De esta forma, en un sistema con múltiples cromóforos, es posible lograr una mayor selectividad trabajando bajo condiciones de excitación bifotónica.

Figura 2. Diagrama ilustrando la producción fotosensibilizada de 1O2 bajo condiciones de excitación mono- y bi-fotónica.

- Fotooxidación de β-carbolinas (βCs) en solución acuosa y producción fotoinducida de EROs, bajo régimen de excitación mono-fotónica.

Se estudia la estabilidad fotoquímica de βCs en solución acuosa y se analiza la capacidad que tienen estos alcaloides de producir especies reactivas de oxígeno tales como H2O2 y 1O2.

Estos estudios involucran el uso de diferentes técnicas analíticas tales como: espectrofotometría UV-vis, HPLC, 1H-RMN, Espectrometría de Masa (EM-IE y UV-LDITOF-MS, etc.), entre otras. Además, se detecta y cuantifica la generación de H2O2 y 1O2 en las soluciones irradiadas, y se evalúa el rol de estas especies reactivas de oxígeno (EROs) en el mecanismo de degradación fotoquímica de βCs. En todos los casos, se determinan los parámetros cinéticos y fotoquímicos correspondientes (rendimientos cuánticos de consumo de reactivos y generación de productos, rendimientos cuánticos de producción de H2O2 y 1O2).

Figura 3

2)Estudio y caracterización de los procesos fotosensibilizados en los que participan las β-carbolinas (βCs).

La radiación solar induce modificaciones al ADN genómico, y también a diferentes proteínas, que pueden inducir el desarrollo de cáncer de piel en seres humanos. Brevemente, estas reacciones pueden ocurrir tanto por excitación electrónica directa de las biomoléculas blanco como por procesos indirectos. En el segundo caso, que involucra reacciones fotosensibilizadas, un determinado compuesto (denominado fotosensibilizador) es excitado debido a la absorción directa de la radiación (UVA o visible) incidente, que luego puede reaccionar directamente con biomoléculas (ADN, proteínas, etc.) o generar EROs que serán las responsables del daño final.

Poco se sabe aún acerca de la contribución de las reacciones fotosensibilizadas a la generación de cáncer de piel en seres humanos. Aunque no son procesos tan efectivos como el daño directo al ADN o a proteínas, por acción de la radiación UVC y UVB, la fotosensibilización representa una contribución importante a la genotoxicidad de la radiación solar. Varios compuestos endógenos o exógenos pueden actuar como fotosensibilizadores y, en este sentido, las βCs representan un buen ejemplo. Por lo tanto, sus propiedades fotosensibilizadoras merecen ser investigadas en profundidad.

- Estudio de interacción y fotosensibilización de biomoléculas de bajo peso molecular por β-carbolinas (βCs).

Comprender los procesos de fotosensibilización de biomoléculas por βCs tiene relevancia desde el punto de vista fotobiológico. Por ejemplo, estos alcaloides son capaces de interaccionar con nucleótidos, producir daño fotoinducido al ADN, inactivar virus, etc. Sin embargo, hasta el momento no se conoce con precisión cuáles son los mecanismos de reacción involucrados en estos procesos. En este sentido, se estudian las propiedades fotosensibilizadoras de βCs sobre compuestos de interés biológico.

En primera instancia, se estudia y cuantifica la interacción entre βCs y desoxirribonucleótidos. En particular, se trabaja con 2'-desoxiguanosina-5'-monofosfato (dGMP), 2'-desoxiadenosina-5'-monofosfato (dAMP) y 2'-desoxicitosina-5'-monofosfato (dCMP). Para este tipo de análisis se recurre, básicamente, a 3 técnicas diferentes, brindando cada una, información complementaria (espectrofotometría UV-vis, fluorescencia y RMN). Asimismo, se estudia el daño fotosensibilizado de βCs sobre estos nucleótidos: se evalúa el efecto del pH y de la concentración de O2 sobre las velocidades de reacción, como así también se analiza el rol de EROs en los mecanismos de daño. En todos los casos, se caracterizan por espectrometría de masa los fotoproductos generados..

- Fotosensibilización de bio-macromoléculas por β-carbolinas (βCs).

Se evalúa el daño fotosensibilizado de moléculas de interés biológico de elevado peso molecular (proteínas, ADN, etc.) por βCs. Los experimentos se realizan en diferentes condiciones de pH, con el objeto de identificar y caracterizar la capacidad fotosensibilizadora de cada forma ácido-base de las βCs. Además, se realizan experimentos comparativos en presencia y ausencia de secuestradores selectivos de EROs, lo que permite evaluar el rol de las mismas en los mecanismos de fotodaño investigados. La figura 4 muestra, a modo de ejemplo, una síntesis de los resultados obtenidos en los experimentos de daño al ADN fotosensibilizado por norharmano.

Además de evaluar la ruptura de la doble hélice que conduce a la relajación del ADN, se caracterizan, mediante métodos enzimáticos, los fotoproductos generados. En particular, las βCs son capaces de fotoinducir la formación de diferentes fotoproductos marcadores típicos de daño mutagénico tales como 8-oxo-guanosina, sitios apurínicos/apirimidínicos y dímeros T<>T (Figura 5). Típicamente, la magnitud y el perfil o espectro de daño observado dependen fuertemente del pH y de la naturaleza química de la βC ensayada. Estos parámetros influyen directamente en la capacidad de interacción de las βCs con el ADN, como así también en las propiedades de los estados electrónicos excitados involucrados y en su grado de protonación. Esto da la posibilidad de que diferentes vías de interacción o daño fotosensibilizado (mecanismos Tipo I, Tipo II o transferencia de energía o una combinación de ellos) tengan lugar (Figura 6).

Figura 4: Evolución de las intensidades relativas de la banda correspondiente al plásmido súper enrollado con el tiempo de irradiación usando diferentes βCs

Figura 5: Daño al DNA otosensibilizado por βCs

 Figura 6:

- Propiedades fotoquímicas, fotofísicas y fotosensibilizadoras de heterociclos naturales sobre sistemas de mayor complejidad.

Los estudios de fotosensibilización de βCs y otros heterociclos relacionados se extienden a otros sistemas biológicos. En particular, se estudia la capacidad de daño de distintos fotosensibilizadores sobre diferentes líneas o cultivos celulares, virus, parásitos y bacterias.

Figura 7: Células HeLa teñidas con Azul de Tripano. a) Control luz: células crecidas en ausencia del fotosensibilizador (Sens) e irradiadas con luz UV-A, b) Sens + hv: células crecidas en presencia del Sens e irradiadas durante 5 min.

 

3) Estudio y desarrollo de sistemas fotocatalíticos, basados en metales de transición, aplicables en la eliminación de contaminantes presentes en emisiones gaseosas.

Esta línea de investigación está orientada a preparar y caracterizar óxidos de metales de transición (puros y mixtos) soportados sobre monolitos para su empleo en reacciones de eliminación de compuestos orgánicos volátiles (COVs). Las técnicas empleadas para eliminar dichos contaminantes son la catálisis convencional y la fotocatálisis. Los sistemas oxídicos que empleamos son del tipo NMOx, con (M = Mn, V) y (N = W, Ce, Au y Pt) entre otros. Se utilizan como soportes de las fases activas monolitos de aluminio y monolitos cerámicos (bentonitas). Finalmente se estudia el comportamiento catalítico de dichos sistemas en reacciones de oxidación completa de contaminantes como etanol, pentano, tolueno y xilenos, entre otros.

El objetivo general de esta línea es el de desarrollar sistemas catalíticos que puedan resolver el problema de la contaminación gaseosa generada por emisiones industriales tanto de compuestos orgánicos volátiles (COVs) como de moléculas inorgánicas como CO, SH2, y NOx. Estas actividades se realizan en cooperación con el Dr. M. A. Peluso (CINDECA-UNLP-CONICET).

 

Publicaciones año 2020

Publicaciones año 2019

 

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